胆汁酸检测：高效液相色谱示差折光法VS荧光法

一、饲料添加剂胆汁酸主成分

二、示差折光法VS荧光法

根据对饲料添加剂中猪胆酸（HCA）、猪去氧胆酸（HDCA）和鹅去氧胆酸（CDCA）的检测方法研究，HPLC-RID（示差折光检测法）和HPLC-FLD（荧光检测法）是目前较为准确的两种分析方法。两者均是基于高效液相色谱仪搭配不同的检测器，其检测原理、前处置、回收率、相对标准偏差等存在很大差异，见表1。

表1.高效液相色谱-示差折光法VS高效液相色谱-荧光法[1]

1平均回收率：回收率是检测方法的“试金石”——它用客观数据回答了一个关键问题：你测到的数值，有多少是真实存在的？

高回收率（90–110%）

准确性可靠：方法能真实反映样本中目标物含量，受基质干扰小；

前处理有效：提取、纯化步骤未造成目标物损失或污染；

系统误差可控：仪器校准、操作规范符合要求。

低回收率（＜80% ）

存在负偏差：目标物被吸附、降解或提取不完全。

2相对标准偏差RSD：是衡量检测数据精密度（Precision） 的核心指标，其数值直接反映重复检测结果的离散程度（波动性）。相对标准偏差（RSD）数值越小越代表“重复检测的一致性”，精密度越高。

三、为什么荧光法需要对胆汁酸进行衍生而示差折光法不需要？

因为两种检测器的检测原理不同。

荧光法：胆汁酸分子不存在共轭结构和发色基团，导致其在紫外-可见光谱范围内没有荧光吸收特性。用荧光检测器法分离测定前，胆汁酸必须经化学衍生后引入显色官能团转变成相应的衍生物，才可在特定波长下显色。简单说就是采用衍生法使胆汁酸带有荧光发色基团，再采用高效液相色谱法对衍生产物进行检测。因柱前衍生步骤较多、操作复杂、衍生过程易受产品中其他物质（如载体）的影响，导致衍生反应不稳定、反应不充分、产生多种衍生化产物、色谱分离困难等问题。结果影响因素较多，对操作人员要求较高，检测结果重复性和再现性差；而且因前处置复杂导致检测时间长，无法连续检测多个样品，检测效率低。

示差折光法：而示差检测器通过连续检测样品流路与参比流路间液体折光指数差值来进行检测；不同的胆汁酸分子结构不同，在特定光源下，具有不同的折射率。样品经简单处置后即可进样检测，检测时间短，可连续检测多个样品（15个样品/工作日）。但流动相的流速波动会影响折射率，所以不适合梯度洗脱；同时示差检测器检测下限约为10-5g/mL至10-7g/mL，不适用于痕量检测（含量在百万分之一以下称为痕量）。但由于饲料添加剂胆汁酸含量较高，HPLC-RID的检出限完全可以满足饲用胆汁酸主成分含量的检测需要。

四、示差折光法（HPLC-RID）VS荧光法（HPLC-FLD）实测结果对比[1]

如表 2-4所示。结果表明，4个样品中3种胆汁酸含量测定结果示差法均较荧光法法高。这可能是因为荧光法需要皂化、衍生后进行HPLC测定，皂化、衍生过程易产生损失，方法回收率、重复性均较示差法低，使其最终总含量略低于 示差法。其次荧光法HPLC-FLD法衍生过程中易受载体基质等影响，造成胆汁酸衍生反应不稳定、衍生效果不稳定，最终导致3种胆汁酸响应值不稳定，特别容易引起批间测定结果差别大，方法重复性和再现性差。而示差折光法HPLC-RID 前处理非常简单，仅需要用流动相提取后直接进行HPLC分析，方法稳定性好，非常适合混合型饲料添加剂中的猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的含量测定。

参考文献

[1]聂倩倩.胆汁酸在动物养殖应用中的检测方法构建[D].上海海洋大学,2024.DOI:10.27314/d.cnki.gsscu.2024.000587.

[2]Azer S A, Hasanato R. Use of bile acids as potential markers of liver dysfunction in humans: a systematic review[J]. Medicine, 2021, 100(41): e27464.

[3]Liu Y, Rong Z, Xiang D, et al. Detection technologies and metabolic profiling of bile acids: a comprehensive review[J]. Lipids in health and disease, 2018, 17(1): 121.